مراحل تجزیه و تحلیل جداسازی کروماتوگرافی گازی

مزیت از کروماتوگرافی گازی  این است که می تواند مخلوطی از اجزای متعدد را جدا و تجزیه و تحلیل کند. با این حال، از آنجایی که مواد زیادی وجود دارند که می‌توانند برای آنالیز کروماتوگرافی استفاده شوند، زمان‌های ظهور پیک‌های کروماتوگرافی اجزای مختلف در یک فاز ثابت ممکن است یکسان باشد، بنابراین تشخیص مواد ناشناخته تنها بر اساس پیک‌های کروماتوگرافی دشوار است. برای یک نمونه ناشناخته، ابتدا باید منبع، ماهیت و هدف تحلیلی آن را درک کنیم. بر این اساس، می‌توانیم یک برآورد اولیه از نمونه انجام دهیم. و سپس از روش خاصی برای انجام شناسایی کیفی بر اساس مواد خالص شناخته شده یا داده های مرجع کیفی کروماتوگرافی مرتبط استفاده کنید. لطفا موارد زیر را ببینید: 

1. منبع و روش پیش تصفیه نمونه ها

نمونه هایی که مستقیماً توسط GC قابل تجزیه و تحلیل هستند معمولاً گازها یا مایعات هستند. نمونه های جامد باید قبل از تجزیه و تحلیل در یک حلال مناسب حل شوند و اطمینان حاصل شود که نمونه ها حاوی اجزایی (مانند نمک های معدنی) نیستند که توسط GC قابل تجزیه و تحلیل نباشند، که ممکن است به اجزای ستون کروماتوگرافی آسیب برساند. به این ترتیب، هنگامی که یک نمونه ناشناخته دریافت می کنیم، باید منبع را درک کنیم تا اجزایی که نمونه ممکن است حاوی آن باشد و محدوده نقطه جوش نمونه را تخمین بزنیم. اگر سیستم نمونه ساده باشد و اجزای نمونه قابل تبخیر باشند، می توان آن را مستقیماً تجزیه و تحلیل کرد. اگر اجزایی در نمونه وجود داشته باشد که نمی‌توان مستقیماً توسط GC آنالیز کرد، یا غلظت نمونه خیلی کم است، باید پیش تصفیه‌های لازم مانند جذب، تجزیه، استخراج، غلظت، رقیق‌سازی، خالص‌سازی، مشتق‌سازی و سایر روش‌ها برای پردازش نمونه انجام شود.       

2. پیکربندی ابزار را تعیین کنید

به اصطلاح پیکربندی ابزار به این اشاره دارد که از چه دستگاه تزریق نمونه، چه گاز حامل، چه ستون کروماتوگرافی و چه آشکارساز برای تجزیه و تحلیل نمونه ها استفاده می شود. 

به طور کلی ابتدا باید نوع آشکارساز مشخص شود. آشکارسازهای FID اغلب برای هیدروکربن‌ها انتخاب می‌شوند و آشکارسازهای ECD برای موادی که دارای گروه‌های الکترونگاتیو بیشتر (F، Cl و غیره) و محتوای هیدروکربن کمتری هستند، آسان است. هنگامی که الزامات حساسیت تشخیص بالا نیست یا اجزای غیر هیدروکربنی در آن گنجانده شده است، آشکارسازهای TCD را می توان انتخاب کرد. برای نمونه های حاوی گوگرد و فسفر می توان آشکارسازهای FPD را انتخاب کرد.             

برای نمونه‌های مایع، می‌توانید روش تزریق پد دیافراگمی را انتخاب کنید و نمونه‌های گاز می‌توانند از شیر شش طرفه یا روش تزریق دفع حرارتی جذب استفاده کنند. کروماتوگرافی عمومی فقط روش تزریق پد دیافراگمی را پیکربندی می‌کند، بنابراین نمونه‌های گاز را می‌توان با استفاده از روش جذب - تجزیه حلال - تزریق دیافراگم آنالیز کرد. 

ستون های کروماتوگرافی مناسب را با توجه به ویژگی های اجزای مورد آزمایش انتخاب کنید و به طور کلی از قانون تشابه و سازگاری پیروی کنید. هنگام جداسازی مواد غیر قطبی، ستون غیرقطبی و هنگام جداسازی مواد قطبی، ستون قطبی را انتخاب کنید. پس از تعیین ستون کروماتوگرافی، دمای کاری ستون کروماتوگرافی با توجه به اختلاف ضرایب توزیع اجزای مورد آزمایش در نمونه تعیین می شود. روش همدما برای سیستم‌های ساده و روش دمای برنامه‌ریزی‌شده برای تجزیه و تحلیل برای سیستم‌های پیچیده با تفاوت‌های زیاد در ضرایب توزیع استفاده می‌شود. 

گازهای حامل معمولاً هیدروژن، نیتروژن، هلیوم و غیره هستند. نیتروژن وزن مولکولی زیادی دارد و اغلب به عنوان گاز حامل برای کروماتوگرافی گازی مویرگی استفاده می شود. هلیوم به عنوان گاز حامل برای طیف سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی استفاده می شود. 

3. تعیین شرایط عملیاتی اولیه

وقتی نمونه آماده شد و پیکربندی ابزار مشخص شد، جداسازی آزمایشی می‌تواند آغاز شود. در این زمان، شرایط جداسازی اولیه باید تعیین شود که عمدتاً شامل حجم تزریق، دمای پورت تزریق، دمای آشکارساز، دمای ستون و سرعت جریان گاز حامل است. حجم تزریق بر اساس غلظت نمونه، ظرفیت ستون و حساسیت آشکارساز تعیین می شود. هنگامی که غلظت نمونه از 10 میلی گرم بر میلی لیتر تجاوز نمی کند، حجم تزریق ستون بسته بندی شده معمولاً 1 تا 5 uL است، در حالی که برای ستون مویرگی، اگر نسبت تقسیم 50:1 باشد، حجم تزریق معمولاً از 2uL تجاوز نمی کند. دمای درگاه تزریق عمدتاً توسط محدوده نقطه جوش نمونه تعیین می شود و دمای عملیاتی ستون کروماتوگرافی نیز باید در نظر گرفته شود. در اصل، داشتن دمای بالاتر در درگاه تزریق، معمولاً نزدیک به نقطه جوش جزء با بالاترین نقطه جوش در نمونه، اما کمتر از دمایی که به راحتی تجزیه می شود، مفید است.             

4. بهینه سازی شرایط جداسازی

هدف از بهینه سازی شرایط جداسازی دستیابی به نتایج جداسازی مورد نیاز در کوتاه ترین زمان تحلیل می باشد. هنگامی که هدف جداسازی خط پایه با تغییر دمای ستون و سرعت جریان گاز حامل قابل دستیابی نیست، باید یک ستون کروماتوگرافی طولانی‌تر یا حتی یک ستون کروماتوگرافی با فاز ثابت متفاوت جایگزین شود، زیرا در GC، ستون کروماتوگرافی کلید موفقیت جداسازی است.   

5. شناسایی کیفی

به اصطلاح شناسایی کیفی برای تعیین انتساب پیک های کروماتوگرافی است. برای نمونه های ساده، می توان آنها را با مواد مرجع مشخص کرد. یعنی در شرایط کروماتوگرافی یکسان، نمونه استاندارد و نمونه واقعی را جداگانه تزریق کنید و مشخص کنید که کدام پیک روی کروماتوگرام جزء مورد تجزیه و تحلیل با توجه به مقدار ماندگاری است. لازم به ذکر است که ترکیبات مختلف ممکن است مقدار نگهداری یکسانی در یک ستون داشته باشند، بنابراین استفاده از تنها یک داده نگهداری برای تعیین کیفی نمونه‌های ناشناخته کافی نیست. روش کیفی شاخص حفظ دو ستونی یا چند ستونی در GC قابل اعتمادتر است، زیرا احتمال اینکه ترکیبات مختلف دارای مقدار نگهداری یکسان در ستون های مختلف باشند بسیار کمتر است. کروماتوگرافی گازی - طیف سنجی جرمی را می توان زمانی که شرایط اجازه می دهد استفاده کرد.   

6. تحلیل کمی

باید مشخص شود که از چه روش کمی برای تعیین محتوای جزء مورد آزمایش استفاده شود. روش‌های کمّی کروماتوگرافی رایج چیزی جز روش درصد سطح پیک (ارتفاع پیک)، روش نرمال‌سازی، روش استاندارد داخلی، روش استاندارد خارجی و روش اضافه استاندارد (که روش برهم‌نهی نیز نامیده می‌شود) نیستند. روش درصدی مساحت قله (ارتفاع قله) ساده ترین اما کم دقت ترین است. این روش فقط در صورتی اختیاری است که نمونه از همولوگ تشکیل شده باشد یا فقط برای کمی سازی تقریبی باشد. در مقایسه، روش استاندارد داخلی بالاترین دقت کمی را دارد زیرا با استفاده از مقدار پاسخ نسبت به استاندارد (به نام استاندارد داخلی) که به ترتیب به نمونه استاندارد و نمونه مجهول اضافه می شود، کمیت می دهد تا خطاهای ناشی از نوسانات در شرایط عملیاتی (از جمله حجم تزریق) جبران شود. در مورد روش افزودن استاندارد، یک استاندارد از ماده مورد آزمایش به صورت کمی به یک نمونه ناشناخته اضافه می شود و سپس یک محاسبه کمی بر اساس افزایش سطح قله (یا ارتفاع قله) انجام می شود. فرآیند آماده سازی نمونه مشابه روش استاندارد داخلی است، اما اصل محاسبه کاملاً از روش استاندارد خارجی مشتق شده است. دقت مقدار قانونی اضافه استاندارد باید بین روش استاندارد داخلی و روش استاندارد خارجی باشد. 

7. تأیید روش

به اصطلاح تأیید روش برای اثبات عملی بودن و قابلیت اطمینان روش توسعه یافته است. عملی بودن به طور کلی به این موضوع اشاره دارد که آیا تمام تنظیمات ابزار مورد استفاده را می توان به عنوان کالا خریداری کرد، آیا روش پردازش نمونه ساده و کار با آن آسان است، آیا زمان تجزیه و تحلیل معقول است و آیا هزینه تجزیه و تحلیل برای همتایان قابل قبول است یا خیر. قابلیت اطمینان شامل محدوده خطی کمی، حد تشخیص، بازیابی روش، تکرارپذیری، تکرارپذیری و دقت است.