نحوه بهینه سازی روش های HPLC برای جداسازی و دقت بهتر 

راهنمای فنی برای مدیران آزمایشگاه، توسعه دهندگان روش، و تیم های تدارکات HPLC 

جداسازی بهتر HPLC به ندرت از تغییر یک تنظیم به صورت تصادفی حاصل می شود. با تعریف جفت بحرانی، حد مورد نیاز گزارش و معیارهای پذیرش شروع کنید. سپس گزینش پذیری صفحه نمایش، ترکیب آلی، pH، سرعت جریان، بار تزریق و دما به آن ترتیب. برای کارهای معمول، انتقال و اعتبارسنجی یک روش ایزوکراتیک پایدار اغلب آسان‌تر است. هنگامی که ترکیبات دیر شسته یا یک محدوده قطبی گسترده زمان اجرا را بیش از حد می کند، ممکن است گرادیان توجیه شود. هدف عملی روشی است که پیک های بحرانی را با حفظ و ناحیه پیک تکرارپذیر حل می کند، در حالی که در داخل فشار، آشکارساز، ستون و محدودیت های نمونه ابزار شما باقی می ماند. 

1. مشکل جداسازی را قبل از تغییر شرایط تعریف کنید

علامت را یادداشت کنید: شستشوی همزمان، باطله، احتباس رانش، فشار برگشتی، پاسخ ضعیف یا زمان اجرای بیش از حد. جفت پیکی که برای انتشار یا تصمیم تحقیق مهم است را شناسایی کنید. بهبود یک ناخالصی جزئی در حالی که قربانی آن جفت می شود، بهبودی نیست. 

اهداف قابل اندازه گیری را تنظیم کنید: تکرارپذیری حفظ، دقت منطقه، وضوح جفت بحرانی، باطله، صفحات و زمان چرخه. حلال نمونه، غلظت، حجم تزریق، ابعاد ستون، مواد افزودنی و طول موج را ثبت کنید تا بتوان تغییرات انتخابی را از تنوع آماده سازی جدا کرد. 

2. ابتدا انتخاب پذیری را تغییر دهید: شیمی ستون، pH و حلال آلی

انتخاب پذیری معمولاً اهرم بیشتری نسبت به یک تنظیم کوچک نرخ جریان دارد. برای سنجش فاز معکوس، فازهای ثابت را با ابعاد و اندازه ذرات کنترل شده مقایسه کنید. C18 یک نقطه شروع مفید است، نه یک پاسخ جهانی. آنالیت های بازی، اسیدی و بسیار قطبی ممکن است به فاز یا سیستم افزودنی دیگری نیاز داشته باشند. 

pH را با یک بافر تعریف شده کنترل کنید و بررسی کنید که pH نهایی در جزء آبی مورد نظر اندازه گیری شود. تغییرات کوچک pH می تواند یونیزاسیون آنالیت و در نتیجه حفظ و انتخاب را تغییر دهد. غلظت بافر، ترتیب آماده سازی، فیلتراسیون و ذخیره سازی را ثابت نگه دارید. اگر روش از افزودنی های فرار استفاده می کند، سازگاری آشکارساز و تمیزی منبع را قبل از مقایسه نتایج بررسی کنید. 

هویت و نسبت حلال را به طور جداگانه نمایش دهید. استونیتریل و متانول می توانند گزینش پذیری متفاوتی در قدرت شستشوی مشابه نشان دهند. یک فاکتور را در یک زمان تغییر دهید یا از یک طرح کوچک استفاده کنید، سپس نتیجه را با فاز موبایل تازه تأیید کنید. یک حلال قوی تر ممکن است دوره را کوتاه کند اما جفت بحرانی را فشرده کند. 

3. عملیات ایزوکراتیک یا گرادیان را عمدا انتخاب کنید

از شستشوی ایزوکراتیک زمانی استفاده کنید که نمونه پنجره نگهداری باریکی دارد و سادگی انتقال اهمیت دارد. ترکیب ثابت تعادل و عیب یابی را ساده می کند. شستشوی گرادیان زمانی کمک می کند که قله های اولیه به شرایط ضعیف نیاز داشته باشند اما ترکیبات دیررس یک دم بلند ایجاد می کنند. متغیرهای حجم ساکن و تعادل مجدد را اضافه می کند. 

برای کار ایزوکراتیک، درصد ارگانیک را در اطراف جفت بحرانی بهینه کنید و حفظ اولین پیک کافی را تأیید کنید. برای یک گرادیان، ترکیب شروع، سطح شیب دار، شستشو و زمان تعادل مجدد را تعریف کنید. اگر ولوم ثابت بین ابزارها متفاوت است، به جای کپی کردن فقط جدول برنامه ریزی شده، زمان را در ورودی ستون مطابقت دهید. 

4. میزان جریان و فشار را در یک پنجره کنترل شده تنظیم کنید

نرخ جریان بر راندمان، فشار و زمان آنالیز تأثیر می گذارد. نزدیک محدوده توصیه شده تامین کننده ستون شروع کنید، سپس یک پنجره باریک کم به بالا را در حین تماشای وضوح و فشار برگشتی آزمایش کنید. جریان کمتر می‌تواند کارایی را در برخی شرایط بهبود بخشد، اما طول را طولانی‌تر می‌کند. جریان بالاتر ممکن است باعث افزایش توان عملیاتی شود و در عین حال کارایی را کاهش دهد یا از حد فشار فراتر رود. فشار را به عنوان یک محدودیت عملیاتی سخت در نظر بگیرید، نه یک هدف عملکرد. 

ChroMini HPLC LC-80MI دارای محدوده سرعت جریان 0.001-5.000 میلی لیتر در دقیقه، دقت جریان <= +/-0.1٪ تحت شرایط تست اعلام شده، دقت جریان RSD <=0.5٪ و حداکثر فشار 5800 psi است. این مقادیر منتشر شده به تعریف یک پنجره غربالگری سمت ابزار کمک می‌کنند، اما آنها جایگزین تأیید اینکه ستون، ویسکوزیته، دما و فاز متحرک انتخابی شما در محدوده ایمن باقی می‌مانند، نمی‌شوند. فشار را در روش نهایی، پس از تعادل، و با یک سیستم تمیز ثبت کنید تا تشخیص رانش در آینده آسان تر باشد. 

5. تزریق، تشخیص و دما را با نمونه مطابقت دهید

حجم تزریق و قدرت حلال می تواند پیک های اولیه جلویی، شکاف یا اعوجاج ایجاد کند. حلال نمونه را در صورت عملی قوی‌تر از فاز متحرک اولیه نگه ندارید، حجم تزریق را برای پیک‌های اضافه بار کاهش دهید و غلظت را در محدوده کاری خطی آشکارساز تأیید کنید. قبل از تغییر شرایط کروماتوگرافی، ویال های تکراری را از همان محلول آماده کنید. در غیر این صورت تنوع آماده سازی می تواند به عنوان یک مشکل جداسازی ظاهر شود. 

طول موج UV را از طیف آنالیت یا یک روش معتبر تنظیم کنید، نه از یک پیش فرض عمومی. Wincom LC-80MI محدوده آشکارساز UV 190-680 نانومتر را مشخص می کند و دقت طول موج +/-1 نانومتر و دقت زیر 0.1 نانومتر را فهرست می کند. اینها حقایق ابزار مفیدی برای برنامه ریزی روش هستند، در حالی که حساسیت واقعی هنوز به جذب آنالیت، غلظت، شرایط سلول جریان و نویز در روش کامل بستگی دارد. 

دما می تواند ویسکوزیته و ماندگاری را تثبیت کند، اما به طور خودکار درمانی برای انتخاب ضعیف نیست. محفظه ستون ترموستات LC-80MI اختیاری است. قبل از تعیین محدوده، پایداری، شواهد کالیبراسیون و سازگاری آن با ستون و فاز متحرک خود، آن را تأیید کنید. 

6. روش بهینه شده را با بررسی مناسب بودن و استحکام سیستم بررسی کنید

پس از انتخاب شرایط، تزریق های استاندارد یا مناسب سیستم را تکرار کنید. قبل از بررسی نتایج، محدودیت ها را تعریف کنید. رزولوشن جفت بحرانی، تکرارپذیری حفظ، دقت ناحیه، باطله و تعداد صفحات را ردیابی کنید. یک خالی برای حمل و یک آماده سازی ماتریس نماینده برای تداخل تزریق کنید. 

استحکام را در اطراف نقطه تنظیم برای درصد آلی، pH، جریان، دما، طول موج و حجم تزریق تست کنید. از تغییرات واقع بینانه استفاده کنید و ابتدا متغیری را که نتیجه بحرانی را تهدید می کند شناسایی کنید. تعداد ستون سند، آماده سازی فاز متحرک، حجم تعادل، پیکربندی و قوانین پردازش. 

⭐ سیستم HPLC فشرده توصیه شده | Wincom ChroMini HPLC LC-80MI

ChroMini HPLC LC-80MI ما یک سیستم ایزوکراتیک همه کاره است که پمپ LC-80، آشکارساز UV80، انژکتور دستی 7725i، ایستگاه کاری WS-80 و یک ستون C18 5 میکرومتری ID 4.6×250 میلی متری را ترکیب می کند. پیکربندی آن کنترل جریان 0.001-5.000 میلی لیتر در دقیقه، حداکثر فشار تا 5800 psi و تشخیص UV از 190-680 نانومتر را فراهم می کند. 

استفاده کنید صفحه محصول ChroMini HPLC LC-80MI برای بررسی پیکربندی فهرست شده، سپس نام آنالیت، شیمی ستون، دستور العمل فاز متحرک، غلظت، حجم تزریق، وضوح هدف و توان عملیاتی نمونه مورد انتظار خود را از طریق ما برای ما ارسال کنید. صفحه تماس . سپس می‌توانیم تأیید کنیم که آیا پیکربندی منتشر شده نقطه شروع مناسبی است یا خیر، آیا به محفظه ستون اختیاری ترموستات مورد نیاز است یا خیر، و اینکه کدام مستندات یا لوازم جانبی باید در نقل قول گنجانده شوند. 

بهینه سازی روش در یک نگاه بررسی می شود

سوالات متداول:

چه زمانی باید از HPLC ایزوکراتیک به گرادیان HPLC تغییر مکان داد؟ 

هنگامی که یک ترکیب ثابت نمی تواند ترکیبات اولیه را به اندازه کافی حفظ کند و ترکیبات دیررس را در یک زمان چرخه معقول شستشو دهد، یا زمانی که گزینش پذیری در محدوده نمونه ضعیف باقی می ماند، تغییر دهید. اگر سادگی انتقال و استحکام معمول غالب است، روش ایزوکراتیک را در جایی که هدف جفت بحرانی را برآورده می کند، حفظ کنید. ما می توانیم گرادیان پیشنهادی را با ابعاد ستون، حجم ساکن و نیاز به تعادل مجدد از طریق دسته تجهیزات HPLC .

آیا LC-80MI می تواند از روشی پشتیبانی کند که نیاز به تشخیص UV زیر 200 نانومتر دارد؟ 

محدوده UV80 منتشر شده 190-680 نانومتر است، بنابراین روشی که به طول موج در آن بازه نیاز دارد در محدوده آشکارساز اعلام شده است. پاسخ آنالیت، جذب فاز متحرک، شرایط سلول جریان و پذیرش نویز خود را با آزمایش مناسب بودن سیستم، قبل از اینکه روش را به‌عنوان معتبر تلقی کنید، تأیید کنید. را ببینید مشخصات LC-80MI .

آیا ستون C18 ارائه شده برای هر آزمایش HPLC مناسب است؟ 

نه. ستون فهرست شده C18 5 میکرومتر، 4.6×250 میلی متر یک پیکربندی شروع تعریف شده است، نه اثبات سازگاری جهانی آنالیت. قطبیت آنالیت، pKa، ماتریس، وضوح هدف، و هر حلال محدود را ارائه دهید تا بتوانیم تأیید کنیم که آیا ستون ارائه شده مناسب است یا فاز ثابت دیگری باید نقل قول شود. شروع کنید با محدوده تجهیزات آزمایشگاهی و آن شرایط را در استعلام خود لحاظ کنید.