اصل کار کروماتوگراف مایع (HPLC) چیست؟  

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)  یک فناوری جداسازی و تجزیه و تحلیل با راندمان بالا بر اساس اصل پارتیشن بندی فاز مایع است. این به طور گسترده ای در شیمی، زیست شناسی، پزشکی، محیط زیست و سایر زمینه ها استفاده می شود. وظیفه اصلی آن جداسازی اجزای مختلف در مخلوط های پیچیده از طریق اعمال فیزیکی یا شیمیایی و ترکیب آنها با آشکارسازها برای دستیابی به تجزیه و تحلیل کمی و کیفی است. در زیر از سه جنبه توضیح داده شده است: اصل کار، ترکیب سیستم و مکانیسم جداسازی.

1. اصل کار: جداسازی بر اساس تفاوت در ضرایب توزیع

اصل اصلی HPLC استفاده از تفاوت در ضرایب توزیع مواد مختلف بین فاز ساکن و فاز متحرک برای دستیابی به جداسازی مخلوط ها است. روند خاص به شرح زیر است:   

تحویل فاز متحرک: پمپ فشار بالا فاز متحرک (معمولاً مخلوطی از حلال آلی و آب) را با سرعت جریان ثابت به داخل سیستم فشار می دهد تا یک جریان مایع پایدار را تشکیل دهد. 

تزریق نمونه: نمونه بردار خودکار مقدار کمی از نمونه را به فاز متحرک تزریق می کند تا یک باند نمونه تشکیل شود. 

جداسازی ستون: نمونه با فاز متحرک (حاوی ذرات فاز ساکن) وارد ستون می شود. خواص شیمیایی یا ساختار فیزیکی فاز ساکن با اجزای نمونه (مانند جذب، توزیع، تبادل یونی و غیره) در تعامل است و در نتیجه زمان‌های اقامت متفاوت هر جزء در ستون ایجاد می‌شود. 

تشخیص و ثبت: اجزای جدا شده به نوبه خود از ستون کروماتوگرافی خارج شده، وارد آشکارساز می شوند (مانند آشکارساز نور مرئی فرابنفش، آشکارساز طیف سنج جرمی و غیره)، به سیگنال های الکتریکی تبدیل شده و به کروماتوگرام ثبت می شوند. 

2. ترکیب سیستم: چهار ماژول اصلی با هم کار می کنند

سیستم HPLC از چهار ماژول کلیدی تشکیل شده است که هر کدام با هم کار می کنند تا به جداسازی کارآمد دست یابند:   

سیستم تزریق

پمپ فشار بالا: فشار پایدار (معمولاً 1-40 مگاپاسکال) را برای اطمینان از سرعت جریان ثابت فاز متحرک از طریق ستون فراهم می کند. نوسانات در نرخ جریان می تواند تکرارپذیری جداسازی را تحت تاثیر قرار دهد.     

دستگاه شستشوی گرادیان: جداسازی نمونه های پیچیده را با تنظیم پویا ترکیب فاز متحرک (مانند قطبیت) بهینه کنید. به عنوان مثال، انتقال تدریجی از یک حلال با قطبیت پایین به یک حلال با قطبیت بالا می تواند زمان تجزیه و تحلیل را کوتاه کند و تقارن پیک را بهبود بخشد. 

سیستم نمونه برداری

نمونه گیری خودکار: حجم تزریق (معمولا 0.1-100 میکرولیتر) را به دقت کنترل کنید تا خطای انسانی کاهش یابد. نمونه‌گر جزئی از تحلیل توالی پشتیبانی می‌کند و می‌تواند چندین نمونه را به طور مداوم پردازش کند.     

سیستم جداسازی

ستون کروماتوگرافی: جزء هسته شامل یک فاز ثابت است (مانند ماتریس ژل سیلیکا، بسته بندی پلیمری). اندازه ذرات (معمولاً 1.8-10 میکرومتر)، اندازه منافذ و اصلاح سطح فاز ثابت راندمان جداسازی را تعیین می کند. پرکننده های اندازه ذرات کوچکتر می توانند کارایی ستون را بهبود بخشند، اما به فشارهای بالاتری نیاز دارند.     

کوره ستونی: دمای ستون را کنترل کنید (معمولاً 20-40 درجه سانتیگراد) تا بر استحکام برهمکنش بین فاز ثابت و نمونه و ویسکوزیته فاز متحرک تأثیر بگذارد و در نتیجه شرایط جداسازی را بهینه کنید.     

سیستم بازرسی و پردازش داده ها

آشکارسازها: بر اساس اصل آشکارسازی به انواع کلی (مانند آشکارسازهای انکساری افتراقی) و انتخابی (مانند آشکارسازهای فلورسانس) تقسیم می شوند. آشکارسازهای فرابنفش به دلیل حساسیت بالا و دامنه کاربرد گسترده به یک نوع رایج مورد استفاده تبدیل شده اند. 

نرم افزار پردازش داده ها: تبدیل سیگنال های الکتریکی به کروماتوگرام، محاسبه زمان ماند، مساحت پیک و سایر پارامترها و دستیابی به تجزیه و تحلیل کمی. 

3. مکانیسم جداسازی: چهار مدل با نیازهای مختلف سازگار می شوند

کروماتوگرافی فاز طبیعی (HPLC فاز نرمال)   

فاز ثابت قطبی (مانند سیلیکاژل) و فاز متحرک غیر قطبی (مانند n-هگزان) است. مناسب برای جداسازی ترکیبات با اختلاف قطبی زیاد مانند ویتامین های محلول در چربی.       

HPLC فاز معکوس 

فاز ثابت غیرقطبی است (به عنوان مثال زنجیره C18) و فاز متحرک قطبی است (مثلاً متانول-آب). این یک مدل پرکاربرد برای جداسازی ترکیبات نسبتاً قطبی به غیر قطبی مانند داروها و پروتئین ها است.     

تبادل یون HPLC 

فاز ثابت باردار می شود (مانند گروه اسید سولفونیک یا گروه آمونیوم چهارتایی) و ترکیبات یونی مانند اسیدهای آمینه و یون های معدنی با عمل الکترواستاتیکی از هم جدا می شوند. 

کروماتوگرافی حذف اندازه (HPLC با اندازه حذف)   

فاز ثابت یک ژل متخلخل است که با توجه به اندازه مولکولی جدا می شود و برای تجزیه و تحلیل توزیع وزن مولکولی ماکرومولکول ها (مانند پروتئین ها و پلیمرها) مناسب است. 

4. مزایای فنی و سناریوهای کاربردی

از مزایای HPLC می توان به راندمان جداسازی بالا، زمان تجزیه و تحلیل کوتاه و مناسب بودن برای ترکیبات ناپایدار حرارتی اشاره کرد. برنامه های کاربردی آن را پوشش می دهد:   

زمینه دارویی: آزمایش خلوص دارو، تجزیه و تحلیل متابولیت؛

پایش محیطی: تعیین هیدروکربن های آروماتیک چند حلقه ای و بقایای آفت کش ها در آب. 

تجزیه و تحلیل مواد غذایی: تجزیه و تحلیل کمی از مواد افزودنی و نگهدارنده. 

تحقیقات بیولوژیکی: جداسازی و خالص سازی پروتئین ها و پپتیدها. 

با بهینه‌سازی پارامترهایی مانند نوع فاز ثابت، ترکیب فاز متحرک و دمای ستون، HPLC می‌تواند به جداسازی کارآمد از مخلوط‌های ساده به نمونه‌های بیولوژیکی پیچیده دست یابد و آن را به ابزاری ضروری در شیمی تحلیلی مدرن تبدیل کند.